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[中西 淳](https://orcid.org/0000-0003-4457-6581)

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[光応答動的材料の開発と細胞移動研究への応用](https://mdr.nims.go.jp/datasets/9c61e9cc-3a9c-42b0-8de7-01a6664a0b61)

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光応答動的材料の開発と細胞移動研究への応用Development of photoresponsive dynamic materials and their applications to cell migration study物質・材料研究機構 高分子・バイオ材料研究センターResearch Center for Macromolecules and Biomaterials, National Institute for Materials Scienceサマリー（英語350ワード，日本語300字）独自に開発した光応答材料を用いて細胞移動現象の解析に利用した研究例を2つ紹介する．1つ目の光応答性基板は光照射によって細胞・細胞集団を動的パターニングできる．細胞がパターニングされた基板を反転させて倒立した状態で細胞移動を誘導することで，細胞集団移動現象における重力ベクトルの影響を明らかにした．2つめの光応答ゲルにおいては，アゾベンゼンの光異性化反応に基づき，UV/VIS光に応じてゲルの弾性率が変化する．乳癌細胞が付着した足場ゲルの弾性率を瞬時に硬化させることで，細胞は基質の突然の弾性率変化に対して一過性の上皮間葉転換応答を示すことを見出した． In this article, I will introduce our original photoresponsive materials and their applications to cell migration studies. The first one is a photoresponsive substrate for dynamic cell patterning. We investigated the influence of gravity vector on collective cell migration by inducing cell migration in the inverted state. The second material is an azobenzene-bearing hydrogel, whose stiffness changes by irradiation of UV/VIS light. We found the breast cancer cells exhibited transient epithelial-mesenchymal transition responses against sudden stiffening of their substrates.英文キーワード（5個）Photoresponsive materials, Collective cell migration, Epithelial-mesenchymal transition, Mechanobiology, Lower critical solution temperature 光応答動的材料の開発と細胞移動研究への応用１．はじめに細胞は生体組織の中における細胞外マトリクス（Extracellular matrix, ECM）に囲まれており，多種多様な生化学・力学的な刺激を受けながら自らの機能や運命を決定している(1, 2)．実験室における細胞培養では，培養皿およびその表面にコーティングしたタンパク質などがこれらの代わりの役割を果たし，吸着タンパク質の種類や密度，配向などに応じてインテグリン-ECM間の錯形成状態が変化し，その結果として細胞内シグナルが制御されることになる．それと同時に，このインテグリン-ECM錯体には，細胞内のミオシンIIの活性を駆動力とする物理的な「力」 も作用するため，細胞-基質界面の先にある基質バルクの力学的な特徴の影響も受ける．例えば，アクリルアミドゲルやポリジメチルシロキサン（PDMS）などの基材でその弾性率を調節すると，細胞の生死あるいは幹細胞の分化系統などが大きく変化する(3)．また近年では，イオン結合や動的共有結合などを架橋点に用いた粘弾性の足場材料によって，細胞に対してより生体ECMに近似した力学環境を提供する試みが進められており(4)，細胞の牽引力に対する基質粘弾性の影響などの理解が深まっている(5)．前者が生化学的な化学平衡（解離定数）に基づくものであるのに対し，後者はレオロジー的な性質，すなわち応力と歪みの関係が支配するもので，荷重速度（周波数）で変化する点に特徴がある．一方で生体内においては，形態形成や病態発生などに伴い細胞周りの環境は絶えず変動する(6)．また実験室でも，これとは似て非なる現象ではあるものの，細胞からECMやプロテアーゼが分泌されることにより，既存のECMを交換・分解／架橋され，基質タンパク質が質的・量的に変化する．さらにメカノバイオロジー的な観点では，細胞が発する牽引力によって，ECMタンパク質の構造変化や集積化などが起こる(7)． すなわち，細胞と基質との相互作用は必ずしも最初に設定した状態のままで留まっている訳ではない．このように多様な時間スケールで変動する基質-細胞間の相互作用を理解するには，材料の生化学・力学的特徴を精密に設計するだけでなく，その時間動態を模倣する技術が有用である(8)．このことを念頭に我々は，光に応答して界面・バルク特性が変化する細胞培養用の動的材料を開発している．本稿ではその材料設計と細胞移動現象の解析に応用した研究例を紹介する．２．光応答界面：細胞集団移動現象への重力ベクトルの影響の解析 細胞集団移動は複数の細胞が細胞間接着を維持したまま集団で移動する現象で，形態形成や創傷治癒から癌細胞の浸潤・転移に至るさまざまな生命現象や病態に関与している(9)．集団を先導するリーダー細胞の出現(10)や生体組織形成にも深く関連する集団移動のキラリティ(11)など，一細胞とは異なる現象が創発する．これらの現象におけるECM由来のoutside-in調節を調べるには，特定のECMタンパク質をコーティングした基材の上で，細胞の移動挙動を解析するという戦略が合理的であるが，細胞移動の解析に広く用いられるWound healing assayではコンフルエント状態の細胞を搔き取って細胞移動を解析するため，移動集団の先導端の形状や搔き取り後の細胞残渣などが均一でないため実験手技に依存することになる．特にリーダー細胞のように，先導端部分に現れる特殊な細胞を論ずる際にはこれが大きな問題となりうる．これに対して我々は，光照射に応じて細胞の付着性が変化する機能性基板を用いて，合理的にかつ再現良く細胞集団移動を解析する手法を提案してきた(12)．この基板は，表面に光分解性の2-ニトロベンジル基を介してタンパク吸着・細胞接着を抑制するポリエチレングリコール（PEG）が修飾されており，表面が光照射に応じて細胞非接着性から接着性へと変化する特徴がある（図1A,B）．基板に対する光照射の空間と時間を制御することで，細胞および細胞集団を任意の形状にパターニングできるだけでなく，培養の最中に光照射を行い細胞接着領域を新調・拡張することで，異なる種類の細胞の共培養やパターン化した細胞・細胞集団の移動を誘導することが可能である（図1C）． Wound healing assayと比べると極めてマイルドに細胞移動を開始させることができるため，細胞集団のサイズや幾何学形状がリーダー細胞の出現に与える影響などを調べられることも可能である(13)．また同様の応答性分子を様々な材料の界面に導入することで，その材料のもつ特徴が細胞集団移動移動に与えるoutside-inの調節を知ることができるようになる．例えば，金ナノ粒子がアレイ状に配列したナノパターン基板や細胞接着性のRGDペプチドの表面密度が制御された自己組織化単分子膜基板，弾性率が制御されたアクリルアミドゲル基板などに本コンセプトを適用することを示している(14-16)．これらの研究を通してリーダー細胞の出現が，中間のRGD密度で極大値をとる二相性応答を示すことや(17)，生化学因子と力学因子が協調作用によって調節されていることなどを明らかにしている(18)．本稿では，光応答基板では細胞移動を遠隔的に誘導できる特徴を利用して，重力ベクトルの影響を調べた最新の研究について紹介する(19)．重力の生物への影響は古くより研究が進んでおり，無／微小重力下における骨密度や筋肉の低下は宇宙飛行士にとっても大きな課題である．このような重力の強度に対する研究に対しては，回転を利用して重力を打ち消す装置（クリノスタット）など用いることができる．一方で，地球重力下で重力方向の違いが与える影響については，内耳に存在する前庭器官の役割が良く知られているものの，一般的な細胞への影響に関する研究は極めて限定的である．例えば，接着細胞の向きを通常の正立状態から倒立状態に変えることで，細胞核の位置や細胞骨格の再配列が起こることが報告されている(20-22)．ただ，そのような細胞骨格系の変化が，重力方向を反転させた瞬間に一時的にのみ観察されると言うものや数日経ってから影響が現れ始めるなどと見解が分かれている．また細胞移動においては，倒立させると一細胞の運動が活発になるのに対して，集団移動能は逆に低下するなどという報告もある(22)．特に倒立状態のままでスクラッチングによって細胞移動を誘導するのは容易でないため，通常は正立の状態でスクラッチングしてから基板を反転するが，先に述べた時間依存性の可能性を加味すると，この方法は必ずしも好ましいものではないのは自明である．そこで，光応答基板において光照射によって遠隔的に細胞移動を誘導できる特徴を利用して，正立状態と倒立状態における細胞集団の移動挙動とリーダー細胞の出現の解析を行った(19)．ここで使用した光応答基板は，金基板上に形成した，ECMリガンドである環状RGDペプチド（cRGD）と光分解性PEG（Photocleavable PEG, PCP），そしてヘキサエチレングリコール（EG6）を有するジスルフィドより構成される混合単分子膜である．最初に正立状態で光照射を行い直径130 μmの円形領域にMDCK（Madin-Darby canine kidney）細胞をパターニングした後に，そのまま，あるいは基板を反転させて，適当なタイミングで周囲の領域を光照射することで細胞移動を誘導した（図2A）。この際，倒立したサンプルにおいては，スペーサーによって基板を嵩上げすることで，細胞がディッシュに圧縮されるのを防ぎつつ細胞周囲の溶液拡散を担保した．このように規格化された細胞集団を対象に正立状態と倒立状態での移動挙動を比較すると以下のようなことが分かってきた．①集団面積の広がり方および集団内の細胞数は倒立になることで低下・減少する．②倒立ではリーダー細胞の出現頻度も低下し，と同時に集団全体の円形度は高い状態で維持される（図2B,C）．①については倒立状態で細胞増殖が弱まるという報告（論文）もあり，且つ細胞増殖と集団面積が相関するのは理に適っているが，②についてはもう少し詳細な解析が必要そうである．そこで，移動誘導前の円形状態における細胞集団内のアクチン線維を染色してみた．すると，倒立にすると集団辺縁部のアクチン束の発現が強まっており（図2D,E），また集団の頭頂部がやたらと平坦になっていることが分かった（図2F, Bleb(-)）．辺縁部のアクチン束は細胞集団の極性形成に重要な役割を果たしており(23, 24)，且つリーダーの形成を抑える働きをしている．したがって，このアクチンの細胞内分布は倒立状態で円形度が高く維持され，リーダー細胞が少なくなる結果をよく説明しうる．一方で，上皮細胞の頭頂面の乱れは細胞間接着の成熟度と関連があるというプレリミナリーな報告もある(25)．そこで，集団内の細胞間隙におけるミオシンリン酸化を免疫染色で調べたところ，倒立状態においてその量が増大していた．ここにミオシン阻害剤であるBlebbistatinを添加すると，頭頂部の平坦化や集団辺縁部でのアクチン束の増強は見られなくなり，且つリーダー細胞の出現頻度も増大した（図2F, Bleb(+); 2G）．したがって倒立状態では，重力ベクトルの反転に適応すべく，細胞骨格の再配列や応力分布の変化が生じ，その結果として集団全体の構造やリーダー細胞の出現に影響を与えていることが明らかになった．この細胞集団としてのアダプティブな応答には，一細胞の状態とは異なるメカニズムで核や他の細胞骨格が関与していることも想像に難くなく，そこには力の作用が重要な役割をしているはずだ．今後，この辺の詳細なメカニズムを調べるとともに，同様の現象が癌化した細胞でも見られるかなど調べていく予定である．３．光応答ゲル：癌細胞に対する基質硬化の影響の解析上の研究は，重力という外的因子が上皮細胞の集団的な性質を変化させる一つの例であるが，形態形成や病態においては上皮間葉転換（Epithelial-mesenchymal transition, EMT），あるいは逆反応の間葉上皮転換（MET）という現象を介してより積極的に細胞の集団性が変化することが知られている(26)．特に悪性化した上皮癌においてはEMTによって癌細胞が間葉的な性質を取得するために原発巣から離脱できるようになるのに対して，転移先ではMETにより再び上皮的な性質を取り戻し転移巣を形成する．したがって，EMT・METは新たに抗がん剤の標的としても注目を集めると同時に(27)，癌細胞がいかにして巧妙に運動性を変化させるのか解明することも科学的に重要だ．その中でも，がんの悪性化と組織の硬化との関連は古くより知られており，細胞周囲の硬さがEMT・METに及ぼす影響も調査対象となってきた(28)．一方で近年のメカノバイオロジーの研究の進歩に伴い，基質の絶対的な弾性率のみでなく，力の荷重速度に寄与する硬さの時間変化などの影響にも注目が集まっている(29)．さらに，間葉系幹細胞の力学記憶などのように(30)，細胞が暴露される力学状態のヒステリシスの重要性が分かってきている以上，力学特性を動的且つ自在に制御できる材料の開発が重要な意味を持つ(8)．そこで我々はUV/VIS光照射に応じて可逆的にcis/trans異性化するアゾベンゼンを側鎖に有する高分子からなるハイドロゲルの開発に着手した(図3A)(31)．注目した高分子は4-Phenylazophenyl acrylate（AzoAA）とN,N-dimethylacrylamide（DMA）とのランダム共重合体（poly(AzoAA-r-DMA)）である（図3B）．この共重合体の下限臨界溶液温度（Lower critical solution temperature, LCST）はアゾベンゼンの異性化状態（cis/trans）によって大きくシフトすることが知られていたため(32)，アゾベンゼンの含有量や共重合体の分子量をうまく調節すれば，細胞培養温度（37℃）付近においてcis/trans転移に応じてこの高分子の相溶/非相溶状態が制御できることになり，それが三次元架橋化した際にハイドロゲルの弾性率変化に反映されるものと期待したわけである．図3Cに最適化した線形高分子の相転移曲線を示す．アゾベンゼンはUV光によって生成されるcis型の方がtrans型よりも極性が高いため，これが故にcis状態で高いLCSTを示している．またこの高分子をキャピラリー内で3次元架橋して（図3D）作製したハイドロゲルの膨潤度測定の結果を図3Eに示す．我々が意図していたように，UV/VIS照射に応じて可逆的にゲルの膨潤・収縮する様子が分かる．ここにおけるゲルの膨潤／収縮はその軟化／硬化に対応する．事実，ゲルの形状をシート状にしてレオメーターでその粘弾性を評価すると，UV光照射によって貯蔵弾性率（G’）が低下することが確認できた．つづいて作製したシートゲルを用いて，ヒト乳腺癌細胞MCF-7（Michigan Foundation Cancer-7）における基質の力学特性の動的変化に対する細胞応答を調べた．ゲル表面にはコラーゲンIを修飾することで細胞接着性を付与し，予めUV光を照射することで軟化させた上でMCF-7細胞を付着させた．播種後24時間で細胞は球状の形態で接着し，48時間では凝集塊のような構造をとることが分かった。この間，上皮的な性質を示すをあらわすE-cadherinの発現量が増大していく様子も確認できた（図3F(i),(ii)）。すなわち，作製したゲルはこの細胞にとって軟らかすぎるため，基質に対して伸展接着するよりも細胞同士の接着を優先し，上皮マーカーが増大したものと考えられる．一方，この途中の12時間および36時間の段階でVIS光を照射することでゲルを硬化させて，再び48時間の時点の細胞形状を観察したところ，早い時点（12時間）で硬化した方が，遅い時点（36時間）に硬化するより大きな凝集塊を形成し，且つE-cadherinの発現量もこれに対応した（図3F(iii),(iv)）。本来，基質硬化という力学刺激の時間的な側面においては，12時間の時点で光照射したものの方がより長く硬い基質（力学刺激）に暴露されているはずなので，より細胞も伸展し，且つE-cadherinの発現量も減少する（すなわちEMTが進行する）ものと予想していたが，得られた結果はそれに反するものであった．恐らく，VIS光照射により硬化したゲルも依然としてMCF-7にとっては軟らかく上皮性が促進される環境なのだが，VIS光照射によって瞬時に硬化した直後にはその変化を感じ取って，一過的にEMT的な応答を示すが，時間の経過とともにその応答が緩和（順応）していくものと想定している。今後，より詳細なメカニズムの解析のために，弾性率変化のキネティクスの違いの影響を調べるとともに，より大きな弾性率変化を示すゲル材料の開発を進めているところである。４．まとめ以上のように，光応答する動的な界面材料およびゲル材料の開発を通して細胞集団移動に関連する現象を調べることができた．特に光の時空間分解能と操作性を利用することで，生化学・力学的因子を精密に設計した材料では見えなかった細胞の特徴・機能を浮き彫りにできることを強調したい．本稿では，紙面の都合で動的材料として外部刺激に応じてその性質が変化するもののみを取り上げたが，「動的材料」という言葉は材料自体に流動性や自由度がある材料にも用いられる．我々は，この方向性の材料として液々界面を足場に用いる動的材料の開発も進めており(33)，これら材料を用いたメカノバイオロジー研究について紹介できる場が持てればと思う．５．謝辞本稿で紹介した研究は，前半の重力ベクトルの影響に関する研究については学振研究員のShimaa Abdellatef博士と東京理科大の大学院生だった榊原伸也君が中心となって行われたものであり，後半の光応答ゲル基板については，当時ポスドクの本間健太博士（現：阪大助教）が中心となり，上木岳士博士（NIMS）との共同研究で進めたものである．また，研究の支援を受けた科研費（18H02010）にも合わせて感謝申し上げる。Reference1. 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Mater. 32, 1905942 (2020).Figure caption図１．光応答界面。(A) 光分解性の2-ニトロベンジル（2-NB）基を介してポリエチレングリコール（PEG）を固定化した光応答基板。光照射に応じて細胞非接着性から細胞接着性へと変化する。(B) 2-NB基の光化学反応。(C) 光応答界面を用いた細胞パターニングと細胞移動の誘導。図２．光応答界面を用いた重力ベクトルの細胞集団移動への影響。(A)倒立状態での細胞移動の誘導。(B-E)正立(黒)・倒立状態(赤)での細胞集団の(B)円形度，(C)リーダー細胞の出現率，(D)アクチン骨格の違い．(E)Dにおける集団辺縁部のアクチン染色量の比較．(F,G) (F)集団頭頂部の構造と(G)リーダー細胞の出現率へのBlebistatinの影響．Fはアクチン共焦点画像より再構成した集団の断面図。図３．光応答ゲル． (A)光駆動弾性率変化の概念図．(B,C) poly(AzoAA-r-DMA)の(B)化学構造と(C)相転移挙動．(D,E)3次元架橋したゲルの(D)化学構造と(E)可逆的な膨潤度変化．(F) 光応答ゲル状でのMCF-7細胞のE-cadherin発現量の変化．ゲル上培養(i)24時間，(ii)48時間での発現量．(iii)12時間，36時間でゲルを光硬化した上での48時間後の発現量．