# Fileset

[2024　分析化学.pdf](https://mdr.nims.go.jp/filesets/af61c147-6a01-4153-86cb-6326451b10dc/download)

## Creator

[吉冨 徹](https://orcid.org/0000-0003-3847-1812), 吉本敬太郎

## Rights

[In Copyright](http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/)

## Other metadata

[血管内皮増殖因子（VEGF）受容体を認識する核酸アプタマー](https://mdr.nims.go.jp/datasets/1d9bc9fc-bb55-41ca-a359-b7df484761f7)

## Fulltext

1　核酸アプタマー核酸アプタマーは，低分子化合物1），タンパク質2），細胞3）など多種多様な標的分子に高い親和性と選択性で結合するDNAや RNAの特異的オリゴヌクレオチドである．試験管内人工進化法［Systematic evolution of ligands by expo-nential enrichment（SELEX）法］を用いたスクリーニングシステムにより，膨大な配列からなる一本鎖 DNA，もしくは RNAの中から，標的分子に対して親和性を有する核酸アプタマーを選抜することができる4）．核酸アプタマーは，抗体とは異なり，標的物質との結合時に構造を大きく変化させるため，薬剤としてだけでなく，分析用のセンサー分子などとしての応用も期待されている．本総合論文では，生体の中で血管新生などに重要な機能を果たしている血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）に結合する核酸アプタマーの選抜法についてはじめに紹介する．また得られた核酸アプタマー群の中から（1）血管新生促進剤，及び（2）シグナリングアプタマーとして機能する分子について，著者らが発表した研究論文を中心に概説する．2　血管内皮増殖因子（VEGF）我々の体は，常に新しい微小血管を作り，体の隅々まで必要な栄養を行き渡らせている．例えば，組織が虚血状態になると，それを解消するために，新しい血管が作られる．また炎症などによっても，血管新生が誘導される．例えば，目を擦った時に，目が充血するのはそのためである．一方で，がん組織においては，多くの栄養を必要とするため，血管新生を亢進させる．これらの現象の中で中心的な役割を果たす生体内の物質が，血管内皮増殖因子（VEGF）とその受容体である血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）である．まずはじめに，VEGFと VEGFRの機能について説明する．ヒト VEGFは，VEGF-Aから VEGF-Dと複数のアイソフォームから構成されており，VEGFファミリーと呼ばれている．なかでも，VEGF-Aは，血管内皮細胞の増殖あるいは生存，血管透過性の亢進などに関与する糖タンパク質である5）．その構造は，分子量約 20 kDaのサブユニットを持つ二量体から成る．VEGF-Aは，VEGFR-1，及び VEGFR-2に結合し，VEGFR-1，及び VEGFR-2のホモダイマー，もしくは VEGFR-1と VEGFR-2のヘテロダイマーを形成し，血管発生や血管新生を誘導するシグナルとして機能する（Fig. 1）．VEGFR-1は，一部の内皮細胞や単球/マクロファージに発現し，VEGFR-2は，ほぼすべての内皮細胞に発現することが知られている． 71血管内皮増殖因子（VEGF）受容体を認識する核酸アプタマー吉 冨 　徹 1，吉本敬太郎＊2血管内皮増殖因子（VEGF）は血管新生を促進する分泌タンパク質であり，その中でも VEGF-Aは，血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）-1及び VEGFR-2に結合し，VEGFシグナル伝達経路を活性化する重要な分子である．著者らは，試験管内人工進化法の配列解析に低頻度配列でも配列を同定することができる次世代シークエンサーを用いて，VEGFR-1及び VEGFR-2に特異的に結合する核酸アプタマー群の探索に成功した．本総合論文では，得られた核酸アプタマー群の構造解析と，（1）血管新生促進剤としての機能，及び（2）シグナリングアプタマーとしての機能についてまとめる．BUNSEKI  KAGAKU    Vol.  73,  No. 3,  pp. 71–78（2024）©  2024 The Japan Society for Analytical Chemistry ＊ E-mail :  keitaro@yoshimotolab.c.u-tokyo.ac.jp 1 国立研究開発法人物質・材料研究機構高分子・バイオ材料研究センター生体組織再生材料グループ :  305-0044　茨城県つくば市並木 1-1 2 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系 :  153-8902　東京都目黒区駒場 3-8-1Fig. 1    Binding properties of VEGF receptor 1 and 2 with vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A)総合論文VEGFRは，細胞外にある外部ドメイン，膜貫通ドメイン，及び細胞内にあるチロシンキナーゼドメインから構成される．VEGFが結合して二量体化することにより，細胞膜の内側にある二つのチロシンキナーゼドメインが近づくことで，細胞内にある別のシグナル伝達タンパク質を刺激し，血管新生を引き起こす．VEGFR-1と - 2は，43.2％ の全体的な配列類似性を有している6）．細胞外ドメインの配列は 33.3％ 類似しており，キナーゼドメインの配列は70.1％ と最も類似している7）．このような VEGFRに対して，VEGF-Aは，VEGFR-2よりも約 10倍高い親和性［解離定数（Kd）: 2-10 pM］で VEGFR-1に結合する7）．近年，VEGF-Aはヒト人工多能性幹細胞や胚性幹細胞から内皮細胞8）や心筋細胞9）への分化誘導に必須な分子の一つとして用いられている．しかしながら，組換え VEGF-Aは安定性が低く，ロット間のばらつきがあり，コストが高いという課題があり，幹細胞を用いた再生治療や関連する基礎研究に用いるには深刻な問題であった．したがって，高価で不安定な VEGFを合成代替品に置き換えることは，生物医学分野，特に幹細胞を用いた再生医療において重要である．このような背景のもと，著者らは，VEGF-Aのように機能する核酸アプタマーの探索を行った．3　VEGFR-1と VEGFR-2に結合する核酸アプタマーの探索VEGF-Aのような核酸アプタマーを得るためには，VEGFR-1と VEGFR-2に両方に結合する核酸アプタマーを選抜する必要がある．そこで，著者らは，VEGFR-1とVEGFR-2の二つの標的分子に対して，交互に SELEX法を行った（Fig. 2）10）．実施した交互 SELEX法について，以下に簡単に説明する．オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）ライブラリーとして，34merのランダム領域を持つ 70merの一本鎖 ODNを用いた．標的分子である VEGFR-1，もしくは VEGFR-2を固定化した 2種類の磁気ビーズを用いた SELEX法を行い，各ラウンドで次世代シークエンサーを用いて配列解析を行った．6ラウンドまで実施し，その結果，Table 1に示す七つの核酸アプタマーを獲得した．VEGFR-1と VEGFR-2の二つの標的分子に対して，交互に SELEX法を行い，最後に VEGFR-2に対してセレクションを行っているにもかかわらず，VEGF-Aと同様に，VEGFR-2に比べて VEGFR-1に対する結合が強い核酸アプタマーが得られた．この理由は明らかになっていないものの，VEGFR-1に核酸アプタマーや VEGF-Aと強力に結合する部位がある可能性を示唆した．本総合論文では，Apt01と Apt02の血管新生促進剤としての機能とApt03- Apt07のシグナリングアプタマーとしての機能に関して紹介する．4　血管新生促進剤として機能する核酸アプタマー著者らは，得られた七つのアプタマーのうち Apt01とApt02の血管新生に与える影響に関して検討した．はじめにK d値についてみてみると，Table 1に示すように，Apt02のほうがApt01よりも低いK d値を有し，VEGFR-1とVEGFR-272 B U N S E K I　K A G A K U  Vol.  73  （2024）Fig. 2    Schematic of alternating consecutive selection of DNA aptamers using VEGFR-1 and VEGFR-2 immobilized on magnetic beads (MB1 and MB2, respectively) with next-generation sequencing analysisReprinted with permission from 10).Table 1    Kd values and G-score of the DNA aptamers against VEGFR-1 and VEGFR-2Name Sequences (5' to 3')Kd (nM)a)G-score b)VEGFR-1 VEGFR-2Apt1 GTCGTGTTTGTTGTTGTTTTCATTTTTGCGGCCC 3.3 100 0Apt2 GCTGATAGGATGGGTTGTAGGTCTAGGGGGGGGCC 1.5 32 20Apt3 GTGATGGTCGGAGATGGATGGGGCAGCTTAGGTC 5.12 82.8 24Apt4 GTCGTGGCGGGGTTTTGTTTTGGTCGGGGGGTG 1.19 164 20Apt5 GGGGGGTGGGGTCGGGTGTTGGTCGTGGGGGGCG 2.09 16.9 50Apt6 TAGGTGGGTTCGGGGGTGCTGGTCGGGGGGTG 1.07 31.0 44Apt7 TGGGTTTAGGTTGGGTGGTTGGGTGGGGGGGGCG 0.922 14.9 49a) Kd values were measured by using a surface plasmon resonance (SPR) sensor.    b) Estimation of G-quadruplex formation by these aptamers was performed using QGSR mapper (https://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php, Analysis conditions; max length, 35; min Group, 2; loop size, 0–36).    The G-Score value is 52 in the analysis of the T95-2T sequence (5'-TTG GGT GGG TGG GTG GGT-3'). に対して高い結合親和性を有することがわかる．一本鎖核酸の二次構造を予測するwebツールであるm-fold11）を使用すると，Apt01と Apt02は共にステムループ構造を形成する可能性があることが示された（Fig. 3）．ここで，それぞれの塩基配列に注目すると，Apt02にはグアニンが豊富な配列が含まれていたのに対し，Apt01には含まれていなかった．Apt02のグアニン四重鎖を形成する可能性を検討するために，グアニン四重鎖の予測ツールである QGRS mapperを用いた12）．QGRS mapperは，入力した塩基配列からグアニン四重鎖を形成する可能性を示すGスコアを出力する．パラレル型のグアニン四重鎖を形成することで知られる T95-2Tと呼ばれる塩基配の Gスコアは，52である13）．解析の結果，Apt01は，Gスコアが 0であるのに対し，Apt02の配列の G-Scoreは 20であった（Table 1）．Apt02の配列の中で，グアニン残基13からグアニン残基33の間の太枠で囲まれたグアニンを使って，グアニン四重鎖を形成する可能性が高いと示された．この m-foldでの構造予測を実験的に確認するために，Apt01と Apt02の円偏光二色性（CD）スペクトル14）を測定した．Fig. 4は Apt01と Apt02の CDスペクトルである．Apt02の CDスペクトルは，約 240 nmと 260 nmにそれぞれ負と正のコットン効果を有する．一方，Apt01は約 250 nmと280 nmにそれぞれ負と正のコットン効果を示す．パラレル型グアニン四重鎖の CDスペクトルは，約 240 nmと 260 nmに，それぞれ負と正のコットン効果を示すことが報告されていることから15），Apt02はパラレル型グアニン四重鎖構造を形成している可能性がある．一方，二本鎖ODNは約 250 nmと 280 nmにそれぞれ負と正のコットン効果を示すことから16），Apt01は Fig. 3に示すようなステム─ループ構造を形成している可能性がある．Apt01とApt02の構造をさらに明確にするために，Apt01と Apt02溶液の 260 nmと 295 nmの吸光度の温度変化を測定し，融解曲線を作成した（Fig. 5）．一般に，グアニン四重鎖の場合，融解の際に波長 295 nmにおける吸光度は減少する17）．Fig. 5Aと Fig. 5Bの黒プロットが示すように，Apt01だけでなく Apt02も，100 mM NaClを含む 10 mMリン酸緩衝液中では，295 nmにおける吸光度は減少しない．一方，100 mM NaClの代わりに100 mM KClを含む 10 mMリン酸緩衝液を用いると，グアニン四重鎖の構造がカリウムイオンの存在によって安定化されるため，Apt02の 295 nmにおける吸光度は減少する．Fig. 4に示した Apt02の CDスペクトルと合わせて考察すると，Apt02はその構造中にグアニン四重鎖形成モチーフを持つことは明らかである．一方，ワトソン・クリック二重鎖を有する場合，波長 260 nmにおける吸光度は増加し，シグモイド曲線を示す17）．Apt01の 260 nmでの融解曲線では，NaClを含むリン酸緩衝液中と KClを含むリン酸緩衝液中で波長 260 nmにおける吸光度は増加し（Fig. 5C），その融解温度はそれぞれ 21.6℃ と 17.6℃ である．この結果は，Apt01が分子内にステムループ構造を持つことを示す．一方，Apt02の融解曲線は 260 nmでシグモイド曲線ではないが，吸光度が上昇し，さらにカリウムイオン存在下ではその変動が減少する（Fig. 5D）．これは，グアニン四重鎖の解離に伴う 260 nmでの吸光度の典型的な変化でFig. 3    Secondary structures of (A) Apt01 and (B) Apt02 estimated using m-fold.    G-rich sequences are included in Apt02, but not in Apt01.    G-scores of Apt01 and Apt02 estimated by QGRS mapper are 0 and 20, respectively.    G-quadruplex-forming guanine residues in the Apt02 sequence, from 13G to 33G, estimated by QGRS mapper are indicated as circles surrounded by thick line.    Reprinted with permission from 10).Fig. 4    Circular dichroism (CD) spectra of Apt01 and Apt02 in PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.5 mM NaH2PO4, pH 7.4).    CD spectrum of Apt02 shows negative and positive peaks at approximately 240 nm and 260 nm, respectively, which corresponded with the spectrum of parallel type G-quadruplexes.    On the other hand, Apt01 shows negative and positive peaks at approximately 250 nm and 280 nm, respectively, which corresponded with the spectrum of the typical double-stranded oligodeoxynucleotides.    Reprinted with permission from 10).総合論文　 73吉冨，吉本  :  血管内皮増殖因子（VEGF）受容体を認識する核酸アプタマーある17）．このように，得られた構造未定の核酸配列も，構造解析ソフト解析，及び CDスペクトルと融解曲線の測定を行うことにより，構造推定を行うことができる．核酸アプタマーは，培養液中のヌクレアーゼによって分解されやすく，標的物質への結合能が減少する．よって，核酸アプタマーの安定性を調べるために，細胞培養液中での Apt01と Apt02のヌクレアーゼ耐性を評価した．Fig. 6に示すように，Apt01は細胞培養液中で 4時間以内にほとんど分解するのに対し，Apt02は 4時間後でもほとんど分解せず，24時間後でさえも，86％ の Apt02が培養液中に残存する．これは，パラレル型グアニン四重鎖構造の形成により分解酵素との相互作用を抑制し，Apt02が高い分解耐性を有していることを示す．得られたアプタマー Apt01と Apt02の血管新生の活性評価するために，マトリゲルからなる三次元ゲル上でアプタマー処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いてin vitroチューブ形成アッセイを行った（Fig. 7A）．Fig. 7Bは画像中のメッシュ数の時間経過を，Fig. 7C-Eは，4，7，24時間後の HUVECsネットワークのメッシュ数を示す結果である．HUVECをマトリゲル上に播種すると，約 24時間後に毛細管様ネットワークを形成する．陽性対照として用いた VEGF165で処理したHUVECでは，4時間で毛細血管様ネットワークを形成し始め，24時間でチューブが壊れ始める．Apt02は VEGF165と同様の挙動を示す．一方，Apt01の存在下では，コントロールと同じような挙動を示し，毛細管様ネットワークは 4時間後には観察されず，24時間後に形成される．チューブの形成は，VEGF165と同様に Apt02によっても促進されるようであるが（Fig. 7C～Fig. 7E），コントロールと Apt01の間には有意な差は見られない．さらに，チューブ形成における親和性の低いオリゴヌクレオチド配列の影響を調べると，親和性が低いネガティブコントロールとして用いたアデニンの 35-mer（A35: AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA）を用いても，HUVECのチューブ形成に影響を与えなかったことから，確かに Apt02の配列が血管新生を促すことがわかる．このように，Apt02は細胞上の VEGFR-1及び - 2と強い親和性を持ち，チューブ形成を促進することがわかる．Apt01と Apt02の違いは，結合親和性の違い，グアニン四重鎖構造によるヌクレアーゼ耐性，VEGFRとの結合部位の違いなどさまざまな要因が影響していると考えられる．5　シグナリングアプタマーとして機能する核酸アプタマー核酸アプタマーは，固相合成が可能で，低コストであること，化学修飾が容易であることから，医薬品や分析用プローブとして有望な分子である．蛍光標識アプタマーは，標的分子との複合体形成によってその立体構造を変化させるため，シグナリングアプタマーと呼ばれ，分析用プロー74 B U N S E K I　K A G A K U  Vol.  73  （2024）Fig. 5    The ultraviolet (UV) melting profiles of aptamers in 10 mM phosphate buffer containing 100 mM NaCl (black colored plots) or in 10 mM phosphate buffer containing 100 mM KCl (white colored plots); (A) Apt01 at 295 nm, (B) Apt02 at 295 nm, (C) Apt01 at 260 nm, and (D) Apt02 at 260 nm.    The melting profiles normalized by the absorbance at 5°C are shown.    The hypochromic transition is observed only in UV melting curve of Apt02 at 295 nm in 10 mM phosphate buffer containing 100 mM KCl, indicating that Apt02 possessed G-quadruplex.    In the UV melting curves of Apt01 at 260 nm, hyperchromic transitions with a single sigmoidal shape indicate that Apt01 possesses the stem-loop structure in the molecule.    Reprinted with permission from 10).Fig. 6    Stability of the obtained aptamer, Apt01 and Apt02, during incubation in Medium 200PRF with LSGS kit for 24 h, as determined by denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).    (A) Representative images of denaturing urea PAGE.    Bands of intact aptamers are indicated with arrows.    (B) Graphical representation of PAGE results.    The fraction of intact aptamers (relative to the sample without incubation in Medium 200 with LSGS kit) was plotted as a function of time.    The bar graphs represent means±standard error for three independent experiments .    Reprinted with permission from 10).ブとして注目を集めている18）．シグナリングアプタマーを開発するための従来の戦略は，標的とする単一のアプタマー上での消光団と蛍光体の修飾位置の最適化に基づいている．しかし，シグナリングアプタマーの設計は，核酸アプタマーが標的分子に結合した際に生じるコンフォメーション変化の予測が非常に困難，さらに核酸塩基の並びによっては蛍光団が消光されやすい場合があるため，蛍光団と消光団の結合位置の最適化は非常に手間のかかる作業である．著者らは，SELEX法と次世代シークエンサー解析によって複数のアプタマー候補を得ることに成功したため，蛍光団や消光団の位置最適化を行わずに両末端に蛍光団と消光団を固定し，標的分子である VEGFR-1と VEGFR-2に結合した際の蛍光団/消光団標識アプタマーの蛍光シグナルを測定した．実施したアプローチの概要について，以下に簡単に説明する．蛍光シグナリングアプタマーとしての性能を評価するために，Apt03から Apt07の五種類のアプタマー配列の5'末端と 3'末端に 6 -カルボキシフルオレセイン（F）とブラックホールクエンチャー（Q）を修飾した F-Apt03-Qから F-Apt07-Qを準備した．準備した修飾アプタマーに，標的タンパク質であるVEGFR-1もしくはVEGFR-2を添加し，蛍光強度変化を測定した．Fig. 8に示すように，五つの修飾アプタマー（F-Apt03-Q to F- Apt07-Q）は，VEGF-1に結合することにより，蛍光シグナルが大幅に増大する．特に，F-Apt03-Qは，2.3倍の蛍光強度が増大した．ここで，注目すべきは，Table 1に示す VEGFR-1に対する Kd値を比較すると，五つの核酸アプタマーの中で，Apt03の Kd値が最も高い値であり，最も結合親和性が低いことがわかる．一Fig. 7    In vitro tube formation assay using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) on a three-dimensional gel consisting of diluted Matrigel.    The cells were treated with Apt01 (10 μM), Apt02 (10 μM), or VEGF165 (10 ng mL–1, 0.26 nM) for 24 h.    (A) Representative images of tube formation of HUVECs on Matrigel, which were treated by aptamers or VEGF165.    Scale bars are 1 mm.    (B) Time course of mesh number in the images of the HUVECs networks at 2, 4, 7, 24 h.    Error bars represent standard deviation of the mean (n = 3 plots).    (C-F) Box plot showing mesh number in the images of the HUVECs networks at (C) 2, (D) 4, (E) 7, and (F) 24 h.    (n = 3 plots).    * P < 0.05 as compared to control.    ** P < 0.05 as compared to Apt01.    Reprinted with permission from 10).Fig. 8    F/F0 (ex. 495 nm, em. 521 nm) values of DNA aptamers bearing a fluorophore and a fluorescence quencher, F-Apt03-Q to F-Apt07-Q, upon addition of target protein; (Black bar) VEGFR-1 and (White bar) VEGFR-2.    Fluorescence spectra were measured using 1 μM of DNA aptamers bearing a fluorophore and a fluorescence quencher and 2 μM of target protein in PBS at 37 °C.    All fluorescence experiments were performed in triplicate and F/F0 is shown as the mean±SD.    Reprinted with permission from 10).総合論文　 75吉冨，吉本  :  血管内皮増殖因子（VEGF）受容体を認識する核酸アプタマー方，VEGFR-1とは異なり，F-Apt03-Qから F-Apt07-QのアプタマーにVEGFR-2を添加しても，蛍光強度の大きな変化は引き起こさず，F-Apt03-Qでは，蛍光強度が減少する．VEGFR-1存在下で F-Apt03-Qの蛍光シグナルが増強されるメカニズムを調べるため，構造解析を行った．まず，アプタマー配列中のグアニン含有量に注目した．Table 1に示すように，グアニンを多く含む配列は，グアニン四重鎖構造を形成する可能性がある19）．QGRS mapperを使って解析してみると，五種類すべての配列がグアニン四重鎖構造を形成する可能性がある．Apt03から Apt07の配列におけるグアニン四重鎖形成を確認するために，各分子の CDスペクトルを測定した．Fig. 9に示すように，パラレル型グアニン四重鎖構造を形成することが知られている ssDNAである T95-2T（5'-TTG GGT GGG TGG GTG GGT-3'）のCDスペクトルは，約 240 nmと 260 nmにそれぞれ負のと正のコットン効果を示した．同様に，Apt03以外の核酸アプタマーの CDスペクトルも T95-2Tと同様のスペクトルの形状を示す．一方，Apt03は約 240 nmに負のコットン効果を示し，260 nmに正のコットン効果は観測されなかった．これらの結果から，Apt04から Apt07はパラレル型グアニン四重鎖構造に折りたたまれていることがわかる．一方，QGRS mapperによる解析では，Apt03はグアニン四重鎖構造に折りたたまれていることが示唆されたが，Apt03の CD測定ではグアニン四重鎖構造の典型的なスペクトルは見られなかった．Apt03から Apt07の構造をさらに明確にするために，融解曲線を測定した（Fig. 10）．Apt04から Apt07まで 295 nmにおける吸光度は減少する（Fig. 10A）．このときの融解温度はそれぞれ 23.4，50.7，37.6，54. 5℃ であった．対照的に，Apt03のUVスペクトルは，295 nmにおける吸光度は減少せず，260 nmでは顕著なシグモイド曲線を示したため，Apt03は配列の一部でワトソンークリック塩基対を形成し，グアニン四重鎖を構造を形成しないことがわかる．核酸アプタマーは，標的分子との結合前後で大きな構造変化を伴うものがある．VEGFR-1と獲得した核酸アプタマーが複合体を形成した際に，グアニン四重鎖を形成しているかどうかを調査した．チオフラビン Tは，非共有結合でグアニン四重鎖を形成する DNAに選択的に結合し，蛍光シグナルの増強を伴う蛍光色素である20）．Fig. 11に示すように，VEGFR-1と Apt04～Apt07の複合体の場合，チオフラビン Tの蛍光強度は増加する．これは，VEGFR-1とApt04～Apt07の複合体内では，グアニン四重鎖構造が安定化していることを示す．一方，VEGFR-1と Apt03との複76 B U N S E K I　K A G A K U  Vol.  73  （2024）Fig. 9    CD spectra of Apt03 to Apt07, and T95-2T.    T95-2T are typical ssDNAs that form three-tetrads G-quadruplexes with parallel-type.    Four micromolar of ssDNA samples were prepared in PBS.    Reprinted with permission from 10).Fig. 10    Denaturation profiles for the seven DNA aptamers against VEGFR-1 and -2 (Apt03 to Apt07) at two different wavelengths: (A) 260 nm and (B) 295 nmReprinted with permission from 10).合体では，チオフラビン Tの蛍光強度の増強は観察されなかったことから，Apt03は VEGFR-1との複合体の中でも，グアニン四重鎖構造を形成していないことがわかる．以上の結果から，著者らは，配列内でワトソン・クリック塩基対を形成する Apt03が標的タンパクの VEGFR-1と結合することで，構造変化が生じ，蛍光団と消光団の距離が長くなることにより，蛍光強度が増大すると考察している．一方，パラレル型グアニン四重鎖を形成する Apt04から Apt07は，結合親和性は高いものの，VEGFR-1との結合前からパラレル型グアニン四重鎖構造を形成し蛍光団と消光団が離れているため，VEGFR-1と結合した際の蛍光の増幅率が低い．以上のように，SELEX法によって獲得した核酸アプタマー群の構造を CD測定や融解温度測定により解析することにより，シグナリングアプタマーとして機能する可能性がある配列を絞り込むことができ，シグナリングアプタマー設計の効率化につながる．4　結　　　言近年，mRNAワクチン等が実用化され，核酸医薬に対する期待はますます高まっている．しかしながら，核酸は，非常に複雑な高次構造を形成するため，動的に変化する核酸アプタマーの構造を正確に把握することは，アプタマーの性能を向上させるために極めて重要である．本総合論文では，SELEX法と次世代シークエンサーを用いて，著者らが探索に成功した血管内皮増殖因子受容体 -1（VEGFR-1）及び VEGFR-2に特異的に結合する核酸アプタマー群の構造解析と，（1）血管新生促進剤として機能，及び（2）シグナリングアプタマーとして機能についてまとめた．本総合論文において説明した構造解析法は，標的物質が変わった場合にも適応することができるため，核酸の構造解析の際に，有益な情報となれば幸いである．謝　　　辞本総合論文で紹介した実験結果は，吉本研究室の学生，及び研究業務員らの協力により得られたことを付記し，ここに謝意を表します．文　　　献  1)  D. E. Huizenga, J. W. Szostak :  Biochemistry-Us, 34, 656 (1995).  2)  L. C. Bock, L. C. Griffin, J. A. Latham, E. H. Vermaas, J. J. Toole :  Nature, 355, 564 (1992).  3)  S. Saito, K. Hirose, M. Tsuchida, K. Wakui, K. Yoshimoto, Y. Nishiyama, M. Shibukawa :  Chem Commun, 52, 461 (2016).  4)  a) C. Tuerk, L. Gold :  Science, 249, 505 (1990); b) A. D. Ellington, J. W. Szostak :  Nature, 346, 818 (1990).  5)  D. I. Holmes, I. Zachary :  Genome Biol, 6, 209 (2005).  6)  N. Rahimi :  Front Biosci, 11, 818 (2006).  7)  M. Shibuya :  Angiogenesis, 9, 225 (2006).  8)  a) M. B. Nourse, D. E. Halpin, M. Scatena, D. J. Mortisen, N. L. Tulloch, K. D. Hauch, B. Torok-Storb, B. D. Ratner, L. Pabon, C. E. Murry :  Arterioscl Throm Vas, 30, 80 (2010); b) T. Ikuno, H. Masumoto, K. Yamamizu, M. Yoshioka, K. Minakata, T. Ikeda, R. Sakata, J. K. Yamashita :  Plos One, 12, (2017); c) T. Ikuno, H. Masumoto, K. Yamamizu, M. Yoshioka, K. Minakata, T. Ikeda, R. Sakata, J. K. Yamashita :  Plos One, 12, (2017).  9)  L. Ye, S. Zhang, L. Greder, J. Dutton, S. A. Keirstead, M. Lepley, L. Y. Zhang, D. Kaufman, J. Y. Zhang :  Plos One, 8, (2013).  10)  a) T. Yoshitomi, F. Wayama, K. Kimura, K. Wakui, H. Furusho, K. Yoshimoto :  Anal Sci, 35, 113 (2019); b) T. Yoshitomi, M. Hayashi, T. Oguro, K. Kimura, F. Wayama, H. Furusho, K. Yoshimoto :  Mol Ther Nucleic Acids, 19, 1145 (2020).  11)  M. Zuker :  Nucleic Acids Res, 31, 3406 (2003).  12)  O. Kikin, L. D'Antonio, P. S. Bagga :  Nucleic Acids Res, 34, W676 (2006).  13)  N. Q. Do, A. T. Phan :  Chemistry, 18, 14752 (2012).  14)  P. Tothova, P. Krafcikova, V. Viglasky :  Biochemistry, 53, 7013 (2014).  15)  S. Masiero, R. Trotta, S. Pieraccini, S. De Tito, R. Perone, A. Randazzo, G. P. Spada :  Org Biomol Chem, 8, 2683 (2010).  16)  V. I. Ivanov, L. E. Minchenkova, A. K. Schyolkina, A. I. Poletayev :  Biopolymers, 12, 89 (1973).  17)  J. L. Mergny, A. T. Phan, L. Lacroix :  FEBS Lett, 435, 74 (1998).  18)  a) N. Soh :  Anal Sci, 34, 515 (2018); b) R. Nutiu, Y. F. Li :  Chem-Eur J, 10, 1868 (2004).  19)  J. R. Williamson :  Annu Rev Bioph Biom, 23, 703 (1994).  20)  T. Chen, S. Tan, W. Li, Y. Zhu :  Anal Sci, 33, 1333 (2017).Fig. 11    Ratio of fluorescent intensity of Thioflavin T in the presence/absence of a complex of aptamers (Apt03 to Apt07)/VEGFR-1Reprinted with permission from 10).                総合論文　 77吉冨，吉本  :  血管内皮増殖因子（VEGF）受容体を認識する核酸アプタマー78 B U N S E K I　K A G A K U  Vol.  73  （2024）Nucleic Acid Aptamer for Recognizing Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ReceptorsToru YOSHITOMI＊1 and Keitaro YOSHIMOTO2＊ E-mail :  keitaro@yoshimotolab.c.u-tokyo.ac.jp  1 Research Center for Macromolecules and Biomaterials, National Institute for Materials Science, 1-1, Namiki, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0044  2 Department of Life Sciences, Graduate School of Arts and Sciences, The University of Tokyo, 3-8-1, Komaba, Meguro-ku, Tokyo, 153-8902(Received October 31, 2023; Accepted December 18, 2023)Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a secreted protein that promotes angiogenesis, and VEGF-A is an important molecule that binds to vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-1 and VEGFR-2 and activates VEGF signaling pathway.    We have successfully identified a set of nucleic acid aptamers that bind specifically to VEGFR-1 and VEGFR-2 using a method with systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) and next-generation sequencer that can identify even low-frequency sequences.    In this comprehensive paper, we summarize the structural analyses of the obtained nucleic acid aptamers and their functions as (1) angiogenesis promoters and (2) signaling aptamers.Keywords: nucleic acid; aptamer; VEGR receptors; VEGF-A; signaling aptamer.